遺伝子治療による眼疾患の処置方法

专利摘要:
要約 ＡＢＣＲタンパク質をコードするアデノ随伴ウイルスベクターを、その必要がある対象に投与することにより、ＡＢＣＡ４遺伝子の突然変異に関連する疾患を処置するための方法；この方法で使用される遺伝子構築物およびアデノ随伴ウイルスベクター。
公开号:JP2011512145A
申请号:JP2010547119
申请日:2009-02-23
公开日:2011-04-21
发明作者:アルベルト オーリッチオ、
申请人:フォンダジオーネ テレソンＦｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｔｅｌｅｔｈｏｎ；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 本発明は、ＡＢＣＲ（「ＡＴＰ結合カセットトランスポーター−レチナール（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ｒｅｔｉｎａｌ）」）タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルスベクターを、その必要がある対象に投与することにより、ＡＢＣＡ４遺伝子の突然変異に関連する疾患を処置するための方法を提供する。本発明はまた、この方法で使用される遺伝子構築物およびアデノ随伴ウイルスベクターも含む。]
背景技術

[0002] 発明の背景
スタルガルト病（Deutman, A.F.a.H.C.B. 2001. Macular dystrophies. St Louis, Missouri, Usa: Schachat, A.P. 1210-1257 pp.）（ＳＴＧＤ）は、可変レベルの中心視力の低下に至る、両眼の中心窩にある錐体の進行性消失からなる黄斑変性症のグループに含まれる常染色体劣性遺伝性疾患である。眼底検査では、黄色斑眼底と呼ばれる状態である、黄斑の周囲の黄色みがかった斑点の存在が頻繁に観察される。これは通常、７歳〜１２歳の年齢で発症し、１００００人に１人の罹患率と推定される。これにより、この疾患は、人生の最初の１０年間および次の１０年間のうちに光受容体細胞に影響を及ぼす遺伝性黄斑変性の最大の原因となり、全ての網膜ジストロフィーのうちの７％に相当する。この疾患は、常染色体劣性遺伝性疾患として最初に報告されたが、優性形式の症例がいくつか報告されている。劣性形式は、症例の９０％を超え、染色体１ｑ２１−ｐ１３での欠損が原因である。優性形式は、６番染色体での変化に関係があると考えられているが、いくつかの研究では１２番染色体上の位置も報告されている。]
[0003] 劣性のスタルガルト病の原因遺伝子は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーの１つのメンバーであるＡＢＣＲタンパク質をコードするＡＢＣＡ４遺伝子と同定されている（Allikmets, R., et al. 1997. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat Genet 15:236-246）。これは光受容体において発現し、外節円板の縁に局在化している。]
[0004] ＡＢＣＡ４の突然変異に関連する他の疾患としては、錐体桿体ジストロフィー（Maugeri, A., et al, 2000, "Mutations in the ABCA4 (ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy" Am J Hum Genet 67:960-966.）および網膜色素変性（Cremers, F.P. et al, 1998. "Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutations in the Stargardt's disease gene ABCR" Hum Mol Genet 7:355-362、Martinez-Mir et al, 1998. "Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR" Nat Genet 18:11-12）が挙げられる。重要なことは、ヒトでのヘテロ接合型ＡＢＣＡ４突然変異（Allikmets, R. et al. 1997 “Mutation of the Stargardt disease gene (ABCR) in age-related macular degeneration" Science 277:1805-1807）が、高齢者にとって最も一般的な失明に至る病である加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）に関連付けられていることである。（Seddon, J.M. 2001. Epidemiology of Age-Related Macular Degeneration. St Louis, Missouri., USA: Schachat, A.P. 1039-1050 pp）。]
先行技術

[0005] Deutman, A.F.a.H.C.B. 2001. Macular dystrophies. St Louis, Missouri, Usa: Schachat, A.P. 1210-1257 pp.
Allikmets, R., et al. 1997. Nat Genet 15:236-246
Maugeri, A., et al, 2000, Am J Hum Genet 67:960-966.
Cremers, F.P. et al, 1998. Hum Mol Genet 7:355-362、
Martinez-Mir et al, 1998. Nat Genet 18:11-12
Allikmets, R. et al. 1997 Science 277:1805-1807
Seddon, J.M. 2001. St Louis, Missouri., USA: Schachat, A.P. 1039-1050 pp]
発明が解決しようとする課題

[0006] 発明の説明
本発明は、ＡＡＶ５キャプシドを有する、ＡＢＣＡ４をコードするアデノ随伴ウイルスベクターの投与、好ましくは眼内投与によって、桿体外節へのタンパク質の局在化と、Ａｂｃａ４−／−網膜の有意であり安定な形態学的および機能的改善とが生じることの発見に基づく。特に、ＳＴＧＤの動物モデルにおいて、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４の網膜下への送達によって、リポフスチンレベル、ＲＰＥの異常、および網膜機能の有意な修正が生じることが見出された。]
[0007] これらの発見によって、最も一般的な遺伝性黄斑変性である劣性スタルガルト病、ならびに錐体桿体ジストロフィー、網膜色素変性、および高齢者について最も一般的な失明に至る病である加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）のような、ＡＢＣＡ４の突然変異に関連する他の疾患に対する有効な治療的手法が提供される。]
[0008] したがって、第１の態様では、本発明は、哺乳動物対象、特に、ＡＢＣＡ４遺伝子の突然変異に関連する疾患に罹患しているヒト個体の網膜の異常および／または網膜機能を修正するための方法を対象とし、前記疾患は、劣性スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、網膜色素変性、および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）から選択されることが好ましく、本発明の方法は、
１）ＡＡＶ５キャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供するステップであって、前記ベクターは、機能性ＡＢＣＲタンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットを有し、ここでは、前記核酸分子は、その転写および翻訳を指示する調節制御エレメントに作動可能に連結している、ステップと、
２）光受容体細胞に前記組換えＡＡＶベクターを形質導入し、それによって、ＡＢＣＲタンパク質の発現が前記細胞中で誘導されるステップと
を含む。]
[0009] ＡＡＶ５キャプシドを有するベクターは、他の血清型よりも効率よく、９ｋｂまで、好ましくは、約４．７ｋｂ〜９ｋｂのゲノムをパッケージングすることができることが証明されており、したがって、本発明によるＡＢＣＡ４遺伝子の送達にそれらを使用することが好ましい。網膜下の空間への送達に好ましく、適切な分子量および生物学的活性の機能性ＡＢＣＲタンパク質の産生を生じる、組換えＡＡＶ２／５ベクターが特に好ましい。]
[0010] 「機能性ＡＢＣＲタンパク質」は、出願人は、ＡＢＣＲタンパク質が天然のタンパク質の機能を示すこと、例えば、このタンパク質が、光受容体細胞に機能を提供するために十分にインビボでＡＴＰを結合することを意味する。好ましくは、機能性ＡＢＣＲタンパク質は、天然のタンパク質の機能の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を示す。機能的活性の決定は、例えば、引用により本明細書中に組み入れられるSun et al., Nature Genetics 26, 242-246 (2000)に記載されている手順に従って行うことができる。]
[0011] 本発明の目的のためには、ＡＢＣＡ４のコード配列（これは、配列番号１（ヒト）および配列番号６（マウス）から選択されることが好ましい）、または遺伝子コードの縮重による同じアミノ酸配列をコードする配列が、哺乳動物の網膜細胞中、特に、光受容体細胞中にある、その発現を調節することができるプロモーター配列に機能的に連結している。本発明に従って使用することができる適切なプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター（配列番号２）、ヒトＲＨＯプロモーター（配列番号３）、ヒトＡＢＣＡ４プロモーター（配列番号４）、およびＣＢＡプロモーター（配列番号５）、転写プロモーター活性を保持しているそれらの断片および変異体が挙げられる。]
[0012] ＡＡＶベクターの構築は、以下の手順に従って、当業者に公知の技術を使用して行うことができる。アデノ随伴ウイルスベクターの構築のための理論および実施方法、ならびに治療における使用は、いくつかの科学的および特許刊行物の中で説明されている（以下の参考文献が、引用により本明細書中に組み入れられる：Flotte TR. Adeno-associated virus-based gene therapy for inherited disorders. Pediatr Res. 2005 Dec;58(6):1143-7、Goncalves MA. Adeno-associated virus:from defective virus to effective vector, Virol J. 2005 May 6;2:43、SuraceEM, Auricchio A. Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer. Prog Retin Eye Res. 2003 Nov;22(6):705-19、Mandel RJ, ManfredssonFP, Foust KD, Rising A, Reimsnider S, Nash K, Burger C. Recombinant adeno-associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders. Mol Ther. 2006 Mar;13(3):463-83）。]
[0013] さらなる態様では、本発明は、（好ましくは、眼投与に適した形態の）ＡＢＣＡ４をコードする配列を発現するＡＡＶベクターを含む医薬組成物に関する。適した投与形態としては、注射剤または懸濁剤、点眼薬、および眼軟膏が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは、網膜下注射によって、例えば、網膜下空間への、前房への、または眼球後部空間への注射によって投与される。ウイルスベクターは、（Bennicelli J, et al Mol Ther. 2008 Jan 22; Reversal of Blindness in Animal Models of Leber Congenital Amaurosis Using Optimized AAV2-mediated Gene Transferに記載されている）網膜下へのアプローチによって送達されることが好ましい。]
[0014] 治療で使用されるウイルスの用量は、投与経路、疾患の重篤度、患者の全身状態、および他の臨床的パラメーターに応じて個別に決定されるべきである。一般的には、適切な投与量は、１０9ｖｇ（ベクターゲノム）／眼から１０13ｖｇ／眼まで様々である。
図面の簡単な説明
図１．ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４のゲノムの完全性。（Ａ）ｒＡＡＶラージプレップから直接単離し（２．５×１０10ＧＣ／レーン）、アルカリアガロースゲル上で分離させたベクターＤＮＡのサザンブロット分析。レーン１は、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４プラスミドから制限酵素消化によって得られたマーカーＤＮＡ断片を含み、レーン２は、ＤｎａｓｅＩ活性の対照とした、ＤｎａｓｅＩで消化したレーン１と同じＤＮＡ断片を含み、レーン３およびレーン４はｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４から単離したゲノムである。レーン３の試料をＤｎａｓｅＩで処理した。（Ｂ）インビボ送達後のｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４ゲノムの長さの評価。（上のパネル）サザンブロット分析に使用した２つのプローブでのｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４ゲノムの模式図。（中央のパネル）ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（レーン１およびレーン２）で、またはＮｃｏＩだけ（レーン３およびレーン４）で消化した、注射していない筋肉由来のゲノムＤＮＡ（レーン１およびレーン３）と、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を注射したマウスの筋肉由来の等量のゲノムＤＮＡ（レーン２およびレーン４）のサザンブロット分析。これらのレーンは同じゲルにあるが、連続していない。矢印は予想した大きさのバンドを示す。（下のパネル）ローティング対照として使用したＰＤＥ６Ｂ遺伝子に特異的なプローブでのサザンブロット分析。分子量を左側に示す。（Ｃ）ｒＡＡＶ２／５を形質導入したＣｏｓ細胞由来の溶解物の抗ＡＢＣＡ４抗体（上のパネル）または抗αチューブリン抗体（下のパネル）を用いたウェスタンブロット分析。レーン１：野生型マウス由来の網膜、レーン２：ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を形質導入した試料、レーン３：ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを形質導入した試料。抗αチューブリンをローティング対照（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。ロードしたタンパク質の量（マイクログラム、μｇ）を、それぞれのレーンの下に示す。] 図１
[0015] 図２．ｒＡＡＶ２／５の送達後のＡＢＣＡ４の発現。] 図２
[0016] ｒＡＡＶ２／５を形質導入したＡｂｃａ４−／−網膜由来の溶解物のＡＢＣＡ４（下のパネル）の、抗ＡＢＣＡ４抗体（上のパネル）、抗αチューブリン抗体（中央のパネル）、および８−アジド−［α−32Ｐ］−ＡＴＰでの標識を用いたウェスタンブロット分析。レーン１：野生型マウス由来の網膜、レーン２：ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を形質導入した試料、レーン３：ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを形質導入した試料。抗αチューブリンをローディング対照として使用した。ロードしたタンパク質の量（マイクログラム、μｇ）をそれぞれのレーンの下に示す。]
[0017] 図３．ｒＡＡＶに媒介される遺伝子導入後のＡｂｃａ４−／−網膜の形態学的分析。（Ａ）１カ月齢でｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを網膜下に注射した４カ月齢のＡｂｃａ４＋／＋マウスおよびＡｂｃａ４−／−有色マウス由来の網膜の切片、ならびにｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を網膜下に注射した対側眼の、抗ＡＢＣＡ４（Ｒｉｍ ３Ｆ４）抗体での免疫組織化学的分析。ＲＰＥ：網膜色素上皮、ＯＳ：外節（光受容体）、ＯＮＬ：外顆粒層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＧＣＬ：神経節細胞層。倍率２０倍。（Ｂ）５カ月齢のＡｂｃａ４−／−有色マウス由来の網膜色素上皮の電子顕微鏡分析。１カ月齢でｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを網膜下に注射した一方の眼（左）、およびｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を網膜下に注射した対側眼（右）由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）。Ｃｈ、脈絡膜；ＢｒＭ、ブルッフ膜。白色の矢印は、より大きな楕円形のメラノソームとは区別される、不規則な形状のリポフスチン色素顆粒を示す。顕微鏡写真は同じ倍率（６０００倍）で撮影した。（Ｃ）ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰまたはｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を網膜下に注射したＡｂｃａ４＋／＋マウスまたはＡｂｃａ４−／−マウス（ｎ＝２個の眼／グループ）のＲＰＥにおけるリポフスチン顆粒の数（左）およびＲＰＥの厚み（右）。] 図３
[0018] 図４．ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を注射したＡｂｃａ４−／−マウスにおけるリポフスチンレベルの低下と光受容体の脱感作からの改善された回復。（Ａ）Ａｂｃａ４−／−マウスの網膜中でのリポフスチンの蓄積に対するｒＡＡＶ２／５に媒介されるＡｂｃａ４遺伝子の導入の影響。生後３０日目に、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を一方の眼（灰色の棒）に注射し、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを対側眼（白色の棒）に注射した、それぞれ、４カ月齢および６カ月齢のアルビノマウスおよびＡｂｃａ４−／−有色マウスの眼杯の中での、Ａ２Ｅ（Ａ２Ｅとイソ−Ａ２Ｅとの合計）レベル、ａｔＲＡＬｄｉ−Ｅレベル、ならびにａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥレベル。月齢が一致するアルビノＢａｌｂ／ｃマウスおよび有色Ａｂｃａ４＋／＋マウスを斜線付きの棒に示す。値は、それぞれ４個の眼杯を含む２つの別々の試料の平均である。（Ｂ）ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４で処置したＡｂｃａ４−／−マウスにおける光受容体の脱感作からの回復の遅れの救出（ｒｅｓｃｕｅ）。ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４（赤色の三角、ｎ＝４個の眼）またはｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（緑色の四角、ｎ＝４個の眼）のいずれかを網膜下に注射した４カ月齢のＡｂｃａ４−／−マウスにおける、および月齢が一致する野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス（黒色の丸、ｎ＝１０個の眼）におけるｂ波の振幅を消し去り（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）後の進行性の回復。データは、平均±標準誤差として示す。アスタリスクは統計学的有意差を示す（Ｐ≦０．０５）。] 図４
図面の簡単な説明

[0019] ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４のゲノムの完全性を示す図である。
ｒＡＡＶ２／５の送達後のＡＢＣＡ４の発現を示す図である。
ｒＡＡＶに媒介される遺伝子導入後のＡｂｃａ４−／−網膜の形態学的分析を示す図である。
ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を注射したＡｂｃａ４−／−マウスにおけるリポフスチンレベルの低下と光受容体の脱感作からの改善された回復を示す図である。実験のセクション方法プラスミド構築物の作製 ＥＧＦＰおよびＡＢＣＡ４をコードするｒＡＡＶの生産のために、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（Auricchio, A., et al. J.M. 2001. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Hum Gene Ther 12:71-76）とｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４プラスミドとを使用した（ＮＣ００１３４７．３ ｎｔ１７４６６１〜ｎｔ１７５２４３に由来するＣＭＶ配列）。ｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４は、ｐＺａｃ２．１プラスミド（Gao, G., et al. J.M. 2000. Purification of recombinant adeno-associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Hum Gene Ther 11:2079-2091）中のＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位との間にマウスＡｂｃａ４ｃＤＮＡ（コード配列、ならびに、いくつかの５’ＵＴＲ領域および３’ＵＴＲ領域を含む７２６８ｂｐ）をクローニングすることによって得た。Ａｂｃａ４ ｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ酵素とＸｈｏＩ酵素とでの消化によってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）Ａｂｃａ４プラスミドから得た。動物モデルとベクターの投与動物についての全ての手順は、動物実験に関する機関の指針に従って行った。Ｂａｌｂ／ｃマウス［Ｒｐｅ６５ Ｌｅｕ４５０（４４）についてホモ接合型］、Ｓｈａｋｅｒ １マウス［Ｃ５７ＢＬ／６ＨＮSDバックグラウンド上にある有効なヌル突然変異である４６２６ＳＢ対立遺伝子を有する（Gibson, F. et al., S.D. 1995. A type VII myosin encoded by the mouse deafness gene shaker-1. Nature 374:62-64）］、ならびに野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｉｔａｌｙ）との交配の成功および戻し交配によって作製された、有色マウス（Weng, J., et al., G.H. 1999. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell 98:13-23）とアルビノＡｂｃａ４−／−マウス（Radu, R.A., et al., G.H. 2004. Light exposure stimulates formation of A2E oxiranes in a mouse model of Stargardt's macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 101:5928-5933）とを使用した。網膜下注射または筋肉内注射のいずれかを行った。網膜下へのベクターの投与を、記載されているように（Liang, F.Q. et al., J. 2000. Intraocular delivery of recombinant virus. MethodsIn Molecular Medicine 47:125-139）、１カ月齢のＡｂｃａ４−／−マウスに行った。網膜下投与と筋肉内注射には４０μＭのプロテオソーム阻害剤（ＬｎＬＬ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、図１Ｂおよび図３に示す実験のためにｒＡＡＶ形質導入を増加させるために補充した（Grieger, J.C., and Samulski, R.J. 2005. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. J Virol 79:9933-9944）。ＡＡＶに媒介される形態学的および機能的救出の評価を目的としたインビボでの実験（図３および図４）には、プロテオソーム阻害剤は使用しなかった。ベクターの投与の前に、マウスを、２ｍｌ／１００ｇ体重のアベルチンの腹腔内注射で麻酔した（Papaioannou, V.E., and Fox, J.G. 1993. Efficacy of tribromoethanol anesthesia in mice. Lab Anim Sci 43:189-192）。その後、マウスに２μｌのｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４（１．２×１０9ＧＣ）を右眼に注射した。同じ用量のｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを、ネガティブ対照として左眼に送達した。筋肉内（ＩＭ）注射を、１５０μｌのｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４（９×１０10ＧＣ）を用いてＣ５７／ＢＬ６マウスの右腓腹筋に行った。統計分析データは、平均±標準誤差として表わす。Ｓｔｕｄｅｎｔｔ検定分析、ＡＮＯＶＡ、および多重度についてのボンフェローニの調整を用いた多重比較検定を、統計学的有意性を示しているかどうかを決定するために使用した。ｒＡＡＶベクターＤＮＡのサザンブロット分析 ＤＮＡを、２．５×１０10個のウイルス粒子（ゲノムのコピー数として測定した）から抽出した。パッケージングされていないゲノムを消化するために、ベクター溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）と１ｍＭ ＭｇＣｌ2とを含む２５０μｌの全量中で、１１μｌのＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）とともに、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＤＮａｓｅを５０ｍＭＥＤＴＡで不活化させ、続いて、５０℃で４５分間、プロテイナーゼＫおよび２．５％Ｎ−ラウリル−サルコシル溶液とともにインキュベートして、キャプシドを溶解させた。ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで２回抽出し、２倍容量のエタノールと１０％酢酸ナトリウム３Ｍとで沈殿させた。アルカリアガロースゲル電気泳動を、以前に記載されているとおりに行った（Sambrook, J.a.D.W.R. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press）。マーカーは、ＮｃｏＩとＮｏｔＩとでのｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４の二重消化によって、７８３５ｂｐのバンドを生成させることによって得た。ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を同定するためには、プローブ２を使用し（図１Ｂ、上のパネル）、一方、他の全てのｒＡＡＶベクターＤＮＡを同定するためには、ポリＡ配列に特異的なプローブを使用した。必要に応じて全てのプローブ配列を利用することができる。ｒＡＡＶの形質導入後の筋肉のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析 ＤＮＡを、ＩＭ注射後２１日目に、Ｈｉｒｔ抽出法（Ｈｉｒｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によってマウスの腓腹筋から単離した（Yang, G.S., et al. 2002. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol 76:7651-7660、Hirt, B. 1967. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol 26:365-369）。ＤＮＡ（３０μｇ）をＮｃｏＩとＮｏｔＩとで、またはＮｃｏＩだけで消化し、０．８％アガロースゲル上で分離し、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（商標）ＩＩランダムプライム標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とα−３２−ＣＴＰとを使用して、製造業者の説明書に従って放射標識した、プローブ１およびプローブ２で（図１Ｂ、上のパネル）、またはＰＤＥ６Ｂ遺伝子に特異的なプローブで（ローティング対照として使用した）で検出した。Ｃｏｓ細胞のｒＡＡＶ感染 Ｃｏｓ細胞を、３×１０5細胞／ウェルの濃度になるように６ウェルプレートに蒔いた。４４時間後、細胞を、１０μＭプロテオソーム阻害剤を含む無血清ＤＭＥＭ中の１０5ＧＣ／細胞のｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰまたはｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４とともにインキュベートした。４８時間後、ウェスタンブロット分析のために、細胞を、剥離させることによって収集した。ウェスタンブロットによるＡＢＣＡ４の発現の分析 ウェスタンブロットを、網膜、およびｒＡＡＶに感染させたＣｏｓ細胞について行った。網膜は、記載されているとおりに収集した（Auricchio, A., et al. J. 2002. Pharmacological regulation of protein expression from adeno-associated viral vectors in the eye. Mol Ther 6:238）。試料をＳＩＥ緩衝液［２５０ｍＭスクロース、３ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）、１％エタノール、および１％ＮＰ−４０］中に、氷上で３０分間溶解させ、８Ｍ尿素を含む試料緩衝液中で３７℃で３０分間加熱することによってタンパク質を変性させ、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。ブロッティングの後、特異的タンパク質を、抗ＡＢＣＡ４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗αチューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ）、および抗ＲＧＲ抗体（ｍｃＤＥ５、ＲＧＲをローティング対照として使用した）を使用して標識した。感染させたＣｏｓ細胞および網膜についての光親和性標識アッセイ（Ｐｈｏｔｏ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ） Ｃｏｓ膜からのタンパク質の抽出を、ｒＡＡＶでの感染の４８時間後に行った。細胞を、低張緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および０．５ｍＭ ＥＤＴＡ］中で収集した。４℃で１時間の後、試料を２８−Ｇ針の中を通過させて細胞を破壊させ、１６０００×ｇで１時間遠心分離した。得られた膜ペレットを再懸濁緩衝液［２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ2］中に溶解させた。] 図１Ｂ 図３ 図４
[0020] タンパク質は、４５％スクロース、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０μＭロイペプチンおよび２ｍＭＰＭＳＦ（２１）の１００μｌ中で網膜をボルテックスすることによって、桿体外節から抽出した。その後、網膜を４０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収し、等量の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および２ｍＭ ＭｇＣｌ2で希釈し、１６０００×ｇで１時間、再び遠心分離した。外節のペレットを３０μｌ再懸濁緩衝液中に溶解させた。]
[0021] 光親和性標識アッセイのために、Ｃｏｓ膜または桿体外節由来のタンパク質抽出物を、１０ｃｍの距離にある紫外線（３２０ｎｍ）下で１分間、４μＭ ８−アジド−［α−32Ｐ］−ＡＴＰ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともに、室温でインキュベートした（Sun, H., Smallwood, P.M., and Nathans, J. 2000. Biochemical defects in ABCR protein variants associated with human retinopathies. Nat Genet 26:242-246）。その後、試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と、加熱せずに混合し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解させた。８−アジド−［α−32Ｐ］−ＡＴＰ標識タンパク質を、オートラジオグラフィーによってＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
ＲＰＥリポフスチン色素の抽出およびＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析を、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４を一方の眼に、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを対側眼に注射した、４カ月齢のアルビノマウスおよび６カ月齢の有色Ａｂｃａ４−／−マウス由来の眼杯について行った。月齢が一致するＡｂｃａ４＋／＋マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウス由来の眼杯を対照として使用した。暗順応させたマウスの眼杯の後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｅｙｅｃｕｐｓ）をプールし（１つの試料につき４個の眼杯）、ホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（１：１）中で３回抽出した（Kim, S.R., et al. 2004. Rpe65 Leu450Met variant is associated with reduced levels of the retinal pigment epithelium lipofuscin fluorophores A2E and iso-A2E. Proc Natl Acad Sci U S A 101:11668-11672）。遠心分離（１０００×ｇ、２分間）後、有機抽出物を、綿およびメタノール中に０．１％ＴＦＡを含む逆相（Ｃ８ Ｓｅｐ−Ｐａｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）カートリッジを通して濾過した。続いて、この抽出物を、アルゴンガス下での溶媒の蒸発によって濃縮し、５０％メタノール性クロロホルム（１個または２個の眼／１０μＬの溶媒）中に再度溶解させ、２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ，２９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒと２４７５ Ｍｕｌｔｉ λ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＡｌｌｉａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、逆相ＨＰＬＣによって分析した。クロマトグラフィーによる分離のために、分析規模のＡｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ｄＣ１８（３μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）カラムを、アセトニトリルおよび水勾配、ならびに０．１％トリフルオロ酢酸（９０％〜１００％、０分〜１０分；１００％アセトニトリル、１０分〜２０分；４３０ｎｍでモニタリング；１０μＬの注入量）とともに利用した。ＨＰＬＣのための抽出および注入は、暗赤色灯下で行った。ピーク面積の積分値（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｅａｋ ａｒｅａｓ）を、Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して決定し、眼杯１個あたりのピコモル濃度を、合成した化合物の外部標準を基準にすることによって、抽出物の全容量に対するＨＰＬＣ注入量の比に対して正規化することによって計算した。Ａ２Ｅ、ａｔＲＡＬｄｉ−Ｅ、およびａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥの合成した標準物の構造は確認されている（Fishkin, N.E.,et al. 2005. Isolation and characterization of a retinal pigment epithelial cell fluorophore:an all-trans-retinal dimer conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A 102:7091-7096、Sakai, N., et al. J.A.C. 1996. J. Am. Chem. Soc.:1559-1560、Fishkin, N., et al. 2004. Absolute configurational determination of an all-trans-retinal dimer isolated from photoreceptor outer segments. Chirality 16:637-641）。
電気生理学的記録
電気生理学的分析（ＥＲＧ）を、４カ月齢のアルビノＡｂｃａ４−／−マウスおよび野生型の月齢が一致するＢａｌｂ／ｃマウスにおいて行った。Ｆｌａｓｈ ＥＲＧを、Ｇａｎｚｆｅｌｄ刺激装置（Ｌａｃｅ）を通じて発生させた１０ｍｓの閃光によって誘発した。電気生理学的シグナルを、オシブプロカイン（ｏｓｓｉｂｕｐｒｏｃａｉｎｅ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ）で予め麻酔した角膜と接触するように下眼瞼の下に挿入した金メッキした電極を通じて記録した。それぞれの眼の電極の基準を、対応する前頭部のレベルで皮下に挿入した針電極とした。様々な電極を２チャンネル増幅器に接続した。１８０分の暗順応の後、マウスを麻酔し、体温を３７．５℃に維持しつつ、暗赤色灯下で定位手術装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ）にゆるく取り付けた。その後、マウスを恒明に曝した。その強度は、８０秒間で３００ｃｄ／ｍ2に設定した（事前順応用の光の照射（ｐｒｅ−ａｄａｐｔｉｎｇ ｌｉｇｈｔ）、消し去り条件（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ））。事前順応用の光の照射（０分、５分、１５分、３０分、４５分、６０分）の後、一定の間隔でｂ波の回復をモニターした。１ｃｄ ｍ-2ｓ-1の閃光に応答したｂ波の振幅を、事前順応用の光の照射後に測定し、事前順応用の光の照射前に測定した値に対する相対値として表わした。
電子顕微鏡による組織学的分析および免疫組織化学
マウスを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２％パラホルムアルデヒドおよび１％グルタルアルデヒドで心臓を通じてかん流させた。その後、眼球を取り出し、２％パラホルムアルデヒドおよび２％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で一晩固定させた。固定させた眼球を、水晶体と硝子体とを剥がして眼杯を残すことができるように切った。この眼杯を１％四酸化オスミウムで処理し、１％酢酸ウラニル水溶液で染色した。その後、標本を脱水し、Ｅｐｏｎ−８１２中に包埋した。それぞれの眼の側頭側（これは、注射した側に相当する）からの薄片を、Ｕｌｔｒａｃｕｔミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）上で調製した。ＥＭ画像は、ＦＥＩＰｈｉｌｉｐｓ Ｔｅｃｎａｉ−１２電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ）下でＵＬＴＲＡ ＶＩＥＷＣＣＤデジタルカメラを使用して、薄片から撮影した。顕微鏡写真は６０００×の倍率で撮影した。リポフスチン顆粒の数の定量分析を、メラノソームを示している高電子密度の大きな楕円形の構造とは異なる、リポフスチン顆粒を示している可変密度のより小さな構造を、それぞれの眼について３つの異なる光学視野についてカウントすることによって行った。ＲＰＥの厚みの測定は、１つの標本あたり２０個の異なる場所で行った（１０箇所は核領域にまたがって測定し、ここでは、細胞はより厚く、１０箇所は細胞と細胞との境界にまたがって測定し、ここでは、細胞はより薄い）。その後、数を平均した。]
[0022] 組織学的分析のために、マウスの眼杯を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に浸すことによって固定し、ＯＣＴ（ｋａｌｔｅｋ）中に包埋した。それぞれの眼について、連続切片（１１μｍの厚み）を水平経線に沿って切り、各スライドに異なるレベルの眼全体の代表的な切片が含まれるように、１０枚のスライド上に分配した。これらの切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とで染色し、網膜の組織学を光学顕微鏡によって分析した。ＡＢＣＡ４染色のために、組織切片を、Ｒｉｍ ３Ｆ４抗体（Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｍｏｌｄａｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａの懇意により譲り受けた）との一晩のインキュベーションの前に、ブロッキング溶液［１×ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ウシ血清アルブミン）および１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯＢＲＬ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、切片を、ＨＲＰに結合した二次抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）とともに１時間インキュベートし、続いて、３０’ＤＡＢ染色（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を行った。対比染色は、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１分間行った。染色した切片をＥｕｋｉｔｔ（Ｋａｌｔｅｋ）上に取り付けた。
結果
ｒＳＴＧＤのマウスモデルでのｒＡＡＶ２／５の投与は網膜の形態および機能を有意に改善する
上記の結果に基づいて、本発明者らは、ｒＳＴＧＤのマウスモデルにおいてＡＡＶ２／５に媒介される網膜への遺伝子導入の有効性を試験した。有色マウス（Weng, J., et al., G.H. 1999. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell 98:13-23）およびアルビノマウス（Radu, R.A., et al. G.H. 2004. Light exposure stimulates formation of A2E oxiranes in a mouse model of Stargardt's macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 101:5928-5933）（Ａｂｃａ４−／−）の中のＡｂｃａ４遺伝子座の標的破壊により、いくつかのｒＳＴＧＤの特徴を概括する表現形が生じる：ＲＰＥ中でのリポフスチンの蓄積、厚みを増したＲＰＥ細胞、ゆっくりとした光受容体の変性、および暗順応の遅れ（Weng, J., et al., G.H. 1999. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell 98:13-23、Radu, R.A., et al. G.H. 2004. Light exposure stimulates formation of A2E oxiranes in a mouse model of Stargardt's macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 101:5928-5933、Mata, N.L., et al. G.H. 2001. Delayed dark-adaptation and lipofuscin accumulation in abcr+/- mice: implications for involvement of ABCR in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:1685-1690）。ｒＡＡＶ２／５に媒介される遺伝子送達によってＡｂｃａ４−／−突然変異の表現形の修正が生じるがどうかを試験するために、１カ月齢のマウスに、一方の眼には２μｌのｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４（１．２×１０9ＧＣに相当する）を、対側眼には同じ用量のｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰを網膜下に注射した。Ａｂｃａ４−／−網膜に対する遺伝子導入の影響を、特に断りのない限りは、３カ月後（動物の月齢：４カ月）に評価した。本発明者らは、最初に、網膜切片についての免疫組織化学によって組換えＡＢＣＡ４の発現を分析し、これが、内因性ＡＢＣＡ４と同様に、報告されているｒＡＡＶ２／５向性から予想したとおり、光受容体の外節に適切に局在化することを見出した（図３Ａ）。] 図３Ａ
[0023] その後、本発明者らは、リポフスチン顆粒および厚みを増したＲＰＥの存在のような、Ａｂｃａ４−／−ＰＲＥの異常に対するｒＡＡＶ２／５に媒介される遺伝子導入の影響を評価した。注射した領域に存在するＲＰＥ細胞の電子顕微鏡による分析によって、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰで処置したものと比較して、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４で処置したＡｂｃａ４−／−網膜において、リポフスチン顆粒数の減少とＲＰＥの厚みの減少が明らかになった（いずれも、Ａｂｃａ４＋／＋ＲＰＥにおいてみられるものと類似している）（図３Ｂおよび図３Ｃ）。これは、ｒＡＡＶ２／５に媒介されるＡｂｃａ４遺伝子の導入が、Ａｂｃａ４−／−表現形に付随するＲＰＥの超微細構造の異常を改善することを示唆している。] 図３Ｂ 図３Ｃ
[0024] 光受容体円板膜を越えるＮ−レチニリデン−ホスファチジルエタノールアミンの輸送におけるＡＢＣＡ４の役割（Sun, H., et al. J. 1999. Retinal stimulatesATPhydrolysis by purified and reconstituted ABCR, the photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter responsible for Stargardt disease. J Biol Chem 274:8269-8281、Beharry, S., et al. 2004. N-retinylidene-phosphatidylethanolamine is the preferred retinoid substrate for the photoreceptor-specific ABC transporter ABCA4 (ABCR). J Biol Chem 279:53972-53979）と一致して、Ａｂｃａ４−／−マウスのＲＰＥの中に存在するリポフスチン顆粒には、ビスレチノイドフルオロフォア（ｂｉｓｒｅｔｉｎｏｉｄ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）Ａ２Ｅ、オール−トランス−レチナール−ダイマー−エタノールアミン（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎａｌ−ｄｉｍｅｒ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ａｔＲＡＬｄｉ−Ｅ）、およびオール−トランス−レチナール−ダイマー−ホスファチジルエタノールアミン（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎａｌ−ｄｉｍｅｒ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥ）が含まれる（Fishkin, N.E.,et al. 2005. Isolation and characterization of a retinal pigment epithelial cell fluorophore: an all-trans-retinal dimer conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A 102:7091-7096）。フルオロフォアＡ２Ｅ、ａｔＲＡＬｄｉ−Ｅ、およびａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥのレベルは、ＥＧＦＰで処置した対側眼と比較して、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−Ａｂｃａ４で処置した、アルビノマウス（月齢：４カ月）および有色マウス（月齢：６カ月）のＡｂｃａ４−／−網膜のいずれにおいても、有意に低下した（図４Ａ）。加えて、光脱感作から回復するＡｂｃａ４−／−光受容体の能力は、対照のＥＧＦＰで処置した網膜と比較して、治療用ベクターで処置した網膜において有意に改善した（図４Ｂ）。網膜の切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色によっては、Ａｂｃａ４で処置した眼もしくはＥＧＦＰで処置した眼のいずれにおいても、炎症性浸潤も、また外顆粒層の厚みの減少も、いずれも明らかにならなかった。] 図４Ａ 図４Ｂ

权利要求:

請求項1
ＡＢＣＡ４遺伝子の突然変異に関連する疾患に罹患している対象の網膜の異常および／または網膜機能障害を処置するための、ＡＡＶ５キャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記ベクターは、機能性ＡＢＣＲタンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットを有し、前記核酸分子は、その転写および翻訳を指示する調節制御エレメントに作動可能に連結している、組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
請求項2
前記疾患が、劣性スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、網膜色素変性、および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）から選択される、ＡＢＣＡ４遺伝子の突然変異に関連する疾患に罹患している対象の網膜の異常および／または網膜機能障害を処置するための、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
請求項3
前記ＡＡＶ５キャプシドを有するベクターが、９ｋｂまでの核酸をパッケージングすることができる、請求項１に記載の方法。
請求項4
ＡＡＶ２／５である、請求項３に記載の組換えベクター。
請求項5
ＡＢＣＡ４のコード配列が哺乳動物の網膜細胞中でのその発現を調節できるプロモーター配列に機能的に連結している発現カセットを有する、請求項１に記載の組換えベクター。
請求項6
前記ＡＢＣＡ４のコード配列が、配列番号１、または配列番号１と同じアミノ酸配列をコードする配列からなる、請求項５に記載の組換えベクター。
請求項7
前記プロモーター配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５、転写プロモーター活性を保持しているそれらの断片または変異体から選択される、請求項５に記載の組換えベクター。
請求項8
眼投与に適した形態である、請求項１から７に記載の組換えベクターを含む製剤。
請求項9
注射剤の形態である、請求項８に記載の医薬組成物。
請求項10
ＡＢＣＡ４遺伝子の突然変異に関連する疾患に罹患している対象の網膜の異常および／または網膜機能を修正するための方法であって、１）ＡＡＶ５キャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供するステップであって、前記ベクターは、機能性ＡＢＣＲタンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットを有し、前記核酸分子は、その転写および翻訳を指示する調節制御エレメントに作動可能に連結している、ステップと、２）光受容体細胞に前記組換えＡＡＶベクターを形質導入し、それによって、ＡＢＣＲタンパク質の発現が前記細胞中で誘導されるステップとを含む方法。
請求項11
前記対象がヒトである、請求項１０に記載の方法。
請求項12
前記疾患が、劣性スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、網膜色素変性、および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）から選択される、請求項１０に記載の方法。
請求項13
ＡＡＶ５キャプシドを有する前記ベクターが、９ｋｂまでの核酸をパッケージングすることができる、請求項１０に記載の方法。
請求項14
前記ベクターがＡＡＶ２／５血清型である、請求項１３に記載の方法。
請求項15
前記ＡＡＶ５キャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＢＣＡ４のコード配列が哺乳動物の網膜細胞中でのその発現を調節することができるプロモーター配列に機能的に連結している発現カセットを有する、請求項１０に記載の方法。
請求項16
前記ＡＢＣＡ４のコード配列が、配列番号１、または配列番号１と同じアミノ酸配列をコードする配列からなる、請求項１５に記載の方法。
請求項17
前記プロモーター配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５、転写プロモーター活性を保持しているそれらの断片または変異体から選択される、請求項１５に記載の方法。
請求項18
光受容体細胞の形質導入が、前記ベクターまたはその製剤の網膜下投与によって行われる、請求項１０に記載の方法。